NAT CHEM丨针对活细胞内源性膜蛋白的DNA编码化学文库辅助筛选
作者：张铭芷
膜蛋白在细胞中执行许多种生物学功能，许多人类疾病与异常的膜蛋白功能有关。近些年来，免疫检查点膜蛋白已在癌症免疫疗法中得到了广泛应用。然而，针对膜蛋白的配体发现是极富挑战性的。不同于胞质蛋白，膜蛋白位于细胞膜的疏水脂质双层，使得体外生物化学技术如蛋白表达和纯化应用极其困难：膜蛋白可能会失去其重要的生物学特征，如翻译后修饰、与辅因子的结合和复合物形成。因此，对于膜蛋白非常需要开发与天然细胞条件相容的配体发现方法。
1992年，Brenner和Lerner提出DNA编码的化学品库（DEL）已经在生物医学领域的研究中发展成为一种功能强大的配体筛选技术。在DEL中，每种化合物都与编码其化学结构的唯一DNA标签缀合。在配体筛选时，将所有文库化合物混合在一起，同时针对目标进行筛选。所选的结合物将通过聚合酶链反应（PCR）扩增和DNA测序进行解码，以读取DNA条形码。DEL可以包含数十亿甚至数万亿的化合物，进行分子库选择仅需几个小时即可完成，这对小分子配体筛选而言是非常经济且高效的。
然而，尽管已有许多课题组报道应用DEL筛选活细胞受体的工作，依赖重组蛋白表达以获得高靶标丰度或使得靶标与大标签融合这一限制使得针对活细胞内源膜蛋白的特异DEL筛选尚未实现。由此，2020年12月21日香港大学李笑宇课题组发表了DNA编码分子库的相关工作，报告了一种可以用DNA标签特异性标记膜蛋白的方法，能够针对活细胞上的内源膜蛋白进行靶标特异性DEL筛选，而无需过度表达或进行任何其他遗传操作。
在活细胞上实现DEL选择需要解决两个重要问题：靶标特异性和靶标浓度。通常，DEL筛选是在库中以小规模（飞摩尔–皮摩尔）进行的，并且需要相对较高的目标浓度（低至中微摩尔）以维持结合平衡。然而，大多数膜蛋白的丰度非常低，如果不进行过表达操作，将很难达到高于或接近解离常数（Kd）的目标浓度。
作者使用DNA标签标记目的蛋白（POI），它可以作为指示信标来指导文库选择。一方面，DNA标签在文库杂交筛选中提供了靶标特异性。另一方面，它通过提高配体亲和力来维持结合平衡，将已识别的分子保留在细胞上。非结合物形成相对不稳定的DNA双链体经过洗脱步骤（热变性，用游离配体选择性洗脱等）后可以被除去。通过典型的DEL解码程序，使用PCR扩增和DNA测序可鉴定结合物类型。
此前许多课题组已开发出多种DNA标记方法。在本工作中，作者使用DNA编程亲和性标记（DPAL）将DNA标签连接至膜蛋白。POI的已知配体与DNA链缀合作为结合探针（BP）。BP与带有光交联剂的捕获探针（CP）形成双链体。BP/CP双链体与POI结合后，紫外线照射触发目标交联。接下来，位移探头（DP）通过toehold位移去除BP，此时，来自CP的DNA标签可用于辅助后续的DEL筛选。
作者首先使用叶酸受体(FR)/叶酸(FA)系统对使用DNA标签特异性标记活细胞上膜蛋白这一方法进行了验证：在FA表达上调的FA缺陷型培养基中培养的HeLa细胞用于标记（HeLaFR），并且将常规HeLa细胞用作对照。首先，将FA与16个核苷酸的DNA作为BP偶联，并准备一个具有苯叠氮化物光交联剂和荧光素（FAM）基团的互补DNA作为CP（BP-1/CP-1）。在短暂的紫外线照射（365 nm，10 s）之前，将BP-1/CP-1双链体与细胞一起孵育以触发交联，同时最大程度地减少细胞损伤。HeLaFR细胞比对照细胞具有更强的荧光。阴性对照（CP不匹配，BP无FA和无紫外线照射）显示低荧光，说明标记是特异的并且依赖于DNA介导的光交联。
作为混合细胞群的测试，将具有低FR表达的HeLaFR和B16-F10细胞分别染色，共培养18小时并用BP-1/CP-1标记。几乎所有标记都发生在HeLaFR细胞上而几乎没有标记B16-F10细胞。
接下来，作者使用toehold介导的链置换反应去除BP以使标记可用于后续的文库杂交。作者使用FAM–BP（BP-2）和包含9 nt-toehold的CP-2标记细胞，并添加DP以从细胞表面置换BP-2。标记后观察到强荧光，而添加DP后大大降低了信号，表明信号丢失是由于DP介导的链置换反应所致。为了确认标签可以与结合DNA的小分子杂交，添加了6 nt长度且FAM标记的BP-3，观察到荧光复原。因此可以证明通过DNA编程亲和性标记（DPAL）方法可以将DNA标签有效标记到活细胞膜蛋白上。
作者接下来验证了这种标记方法在抗体辅助标记膜蛋白上的可行性。为了减少抗体与标签产生的自我标记反应，DNA标签连接标记基团的一段延长了n个碱基以拉开与抗体之间的空间距离。
最后，作者将上述建立的方法应用于膜蛋白的小分子靶标筛选，同样地，作者选择使用FR/FA系统进行验证。作者建立了一个具有4,800种三肽化合物的DEL，并掺入FA-DNA作为阳性对照，与包含4,801种编码的DEL一起孵育。CP-3具有与引物结合位点互补的7个核苷酸序列，且杂交增加了配体亲和力并稳定了双链体。因此，特异性识别的FA被保留在细胞上，而未识别的分子被洗去。尽管其他细胞表面蛋白也与文库化合物相互作用，但由于相互作用缺乏DNA标签的支持同样会被洗去。结果显示，标记的细胞FA被高度富集，且FA未被未标记的细胞富集。
作者还进行了具有3042万个三肽化合物的大规模DEL筛选，选择针对带标记（用FA–BP辅助）或未标记HeLa细胞的FR的文库。结果显示，用标记细胞进行的选择鉴定出了几种明显富集的化合物（H1-H5），它们在对照选择中并未富集。H2–H5显示低的微摩尔亲和力，而H1具有58 nM的相对高的结合亲和力。
总而言之，作者开发了一种针对活细胞上的膜蛋白选择DEL的方法，使得在靶标浓度低的情况下，在靶标上连接DNA标签提供归巢信标以指导文库杂交并促进配体结合。可以预见，该方法可加快许多膜蛋白的配体发现，且在细胞环境下进行筛选。此外，DELS的巨大多样性还可以被用于细胞膜蛋白的高通量筛选方法。
Ref: Huang, Y., Meng, L., Nie, Q. et al. Selection of DNA-encoded chemical libraries against endogenous membrane proteins on live cells. Nat. Chem.13, 77–88 (2021).
