SCI ADV丨基于异-多价拓扑匹配的纳米结构对甲型流感病毒具有强力及广谱抑制作用
作者：徐锐
今天给大家分享是近期发表在“Science Advance”上的一篇文章。题目为“Heteromultivalent topology-matched nanostructures as potent and broad-spectrum influenza A virus inhibitors”。文章的通讯作者分别是来自 Freie Universitätg大学的Stephan Block教授和Rainer Haag教授、来自四川大学的Chong cheng教授，以及来自Robert Koch病毒研究所的Thorsten Wolff教授。
甲型流感病毒(IAV)是广泛存在于人类及其他动物中的强传染性病原体。由于其RNA聚合酶在RNA复制过程中的高错误率，使得人类IAV的进化常常伴随着不可预测的抗原漂移，这就导致了现有的抗病毒药物效用降低或者无效。在本论文中，作者开发了一种针对IAV的广谱抑制剂。
病毒的感染过程从病毒与宿主细胞膜表面受体结合开始。因此，如果能够通过诱骗结合从而阻断病毒与宿主结合就可以抑制病毒的感染。对IAV而言，两种糖蛋白在病毒与细胞膜的结合过程中有关，分别是血凝素（HA）和神经酰胺酶（NA）。HA与细胞膜上的唾液酸受体的多价结合引发病毒的侵入。因此，已经有人工合成的聚唾液酸结构用于IAV的抑制。但是由于不同IAV毒株HA结合空腔的多样性，开发针对IAV的光谱抑制剂仍然是一个挑战。然而天然的细胞膜因为其复杂，动态和多价唾液酸的存在对IVA具有很强的结合力。且细胞膜的提取过程相较于合成与HA上结合空腔匹配的带有多价唾液酸的纳米结构而言更为简单。
IAV与宿主细胞膜结合后，NA可以分解唾液酸并且释放出病毒粒子。HA-NA的相互作用使得IVA与宿主细胞的相互作用在感染的早期及晚期保持平衡。因此，同时抑制HA和NA两种蛋白显得尤为重要。作者结合了三种想法开发出了IAV的光谱抑制剂（图1）。（i）将抑制剂表面包被上细胞膜作为天然唾液酸的来源。（ii）在此细胞膜标记上扎那米韦（Zan），一种NA抑制剂可以提高IVA与细胞膜的结合。（iii）用拓扑匹配的凹面形状通过增大与IAV的作用面积进一步增强IAV与细胞膜的作用。
图1. 用于抑制病毒的异-多价拓扑匹配纳米结构的设计。
大多数IAV毒株可以主动与红细胞结合，因此作者首先验证了提取的红细胞膜（RBCm）仍可以与IVA结合。并通过TIRF完成了RBCm对IVA的抑制实验。首先在玻璃表面构建一层含有神经节苷脂GD1a的磷脂双分子层膜（SLB），用于监测IAV与此膜的瞬时作用。当加入的RBCm浓度增大时，会减弱IAV与GD1a之间的相互作用。IC50TIRF（TIRF观测到的最大抑制浓度的一半）为2.9±1.2 ug/mL。并且通过对A/X31 (H3N2), A/Panama/2007/1999 (H3N2), A/PR/8/34
(H1N1), 和 A/Bayern/63/2009 (H1N1pdm)进行的血凝反应抑制实验都得到了在纳摩尔范围内的抑制常数（KiHAI），证明RBCm具有光谱的IAV结合能力。（表1）
表一. RBCm囊泡对于不同IAV毒株在血凝反应中的抑制常数
在细胞感染实验中，作者用了MDCK-II细胞作为IAV的感染宿主细胞。在RBCm存在的情况下，A/X31 (H3N2)的感染能力有所降低，因此需要进一步提高RBCm对IAV的抑制能力。
于是作者从以下两个方面对RBCm进行了改：（i）在RBCm表面赋予NA抑制剂以增强与病毒的结合能力。（ii）将RBCm结合到纳米颗粒表面，通过拓扑匹增加RBCm与IAV的接触面积。同样，通过血凝抑制实验，观察到游离的Zan降低了RBCm囊泡的KiHAI值，证明抑制NA可以提高病毒颗粒的结合能力。经过RBCm-Zan处理的病毒的NA活性与经过“RBCm+游离Zan”处理的病毒的NA活性相近，但是KiHAI值更低。这说明Zan除了可以抑制NA的活性，还可能提高了与病毒粒子的结合能力。（表2）
表2. 不同样品对A/X31(H3N2 )
进一步，作者将SLB中嵌入RBCm囊泡，Zan耦合磷脂或者是两者的混合物，通过TIRF监测IAV在不同多糖结构存在下与SLB的结合能力。结果表明与单独的Zan表面或者RBCm表面相比，IAV与RBCm-Zan表面的结合能力高出三倍。（图2）
图2.异-多价表面与IAV的相互作用
接下来，作者将合成了两种不同形状的具有生物惰性和生物稳定性的纳米粒子：圆形（NS）和碗状（NB）。将RBCm通过疏水作用包被在纳米粒子表面，分别形成NS-RBCm和NB-RBCm。NB-RBCm的IC50infection inhibition值比NS-RBCm低四倍，这应该得益于NB-RBCm与IAV病毒颗粒具有相匹配的形状，从而能够更好地与病毒颗粒结合。（图3）
图3.通过拓扑匹配原则增大与病毒颗粒的相互作用。
最后，作者将上述概念相结合，即将磷脂耦合的Zan插入到NB-RBCm表面，得到异-多价纳米碗（Hetero-MNB）。细胞实验结果显示，由于Hetero-MNB对HA和NA的抑制作用，IAV结合MDCK-II细胞的能力显著地被抑制。
图4. 异-多价拓扑匹配纳米结构抑制IAV感染。
本研究首次证实了具有拓扑匹配结构的新型异质多价高分子纳米制剂可高效广谱（99.99%）的抑制流感等致命病毒。由于新冠病毒与流感病毒在结构、感染症状及感染周期上有许多相似之处，研究团队认为通过设计具有靶向S蛋白不同结构域的多价键纳米结构也将为制备高效的新冠病毒高分子抑制剂提供全新的研发策略。
