NAT NANOTECHNOL丨一种基于氟化高分子个性化肿瘤疫苗的构建策略—用于术后肿瘤免疫治疗
作者：高倩倩
今天给大家分享的是近期发表在“Nature Nanotechnology”上的一篇有关肿瘤免疫治疗文章。文章题目为“A general strategy towards personalized nanovaccines based on fluoropolymers for post-surgical cancer immunotherapy”。文章的通讯作者分别是来自苏州大学的刘庄教授、彭睿教授和华东师范大学程义云教授。刘庄教授的研究方向主要集中于生物材料与纳米医学领域，围绕肿瘤诊疗中的若干挑战性问题，发展了一系列新型纳米探针用于体外生物检测与活体分子影像，并探索了多种基于纳米技术和生物材料的肿瘤光学治疗、放射治疗、免疫治疗等新策略。彭睿教授的主要研究方向是在分子细胞生物学研究基础上，结合纳米技术，系统研究了多种纳米材料的免疫学效应，发展了多种新型纳米载体用于肿瘤免疫联合治疗。程义云教授的研究方向主要为纳米材料、生物相容性材料在早期癌症诊断及植入治疗中的应用研究及人体药物运输等方面的研究。
术后肿瘤转移及复发仍然是临床上肿瘤治疗失败的主要原因，近几年肿瘤的免疫疗法为抗击肿瘤带来了巨大的希望。有研究指出术后免疫疗法，如检查点阻断疗法有可能会减少肿瘤的复发和转移，然而其疗效还有待提高。肿瘤疫苗作为肿瘤免疫治疗的一种方法，可以诱导肿瘤特异性的免疫反应。肿瘤疫苗发挥作用的关键是激活并使肿瘤特异性的T细胞大量增殖。目前有关纳米疫苗的研究主要集中于同时输送肿瘤特异的抗原和佐剂到抗原呈递细胞。在此过程中，抗原提呈细胞通过主要组织相容性复合体I类(MHC-I)抗原提呈途径进行抗原胞浆传递和交叉提呈是触发强有力抗肿瘤反应的关键。因此，为了制造高效的癌症纳米疫苗，开发抗原载体作为免疫佐剂，并能够将抗原直接运送到抗原提呈细胞的胞中是至关重要的。在本研究中作者提出一种基于氟化高分子（F13-PEI）个性化肿瘤疫苗的通用构建策略，用于术后癌症免疫治疗。经研究发现，将氟聚合物与模型抗原卵白蛋白混合形成的纳米颗粒，不仅可以通过Toll样受体4(TLR4)介导的信号通路诱导树突状细胞成熟，而且可以促进抗原在树突状细胞的胞浆运输，从而显著增强抗原交叉呈递。更重要的是，在B16黑色素瘤和CT26结肠癌皮下肿瘤模型和自发转移的原位4T1乳腺癌肿瘤模型中证明，将该氟化高分子与从自体原发肿瘤中提取的细胞膜混合后，可以协同检查点阻断疗法抑制术后肿瘤的复发和转移。此外，在原位4T1乳腺癌肿瘤模型中，作者观察到该F13-PEI/Mem个性化纳米疫苗能显著增强机体对肿瘤的免疫记忆，可以有效地保护治愈的小鼠免受肿瘤的再次攻击。
1. 氟聚合物用于抗原递送
图1 纳米疫苗的制备、表征及DC活化。a. F-PEI/OVA纳米疫苗制备示意图。 b. 用动态光散射法测量不同聚合物/OVA比（w/w）制备的F7-PEI/OVA和F13-PEI/OVA纳米粒子的流体力学尺寸。 c. 氟化高分子纳米颗粒的TEM图像。 d. F7-PEI/OVA和F13-PEI/OVA的Zeta电位。 e. 随着PEI/OVA、F7-PEI/OVA或F13-PEI/OVA NPs的OVA浓度增加，孵育24小时后BMDC的相对存活率。 f-i. CD86+CD80+（f）、CD40+（g）、MHC-II+BMDC（h）和OVA抗原交叉呈递的统计数据。（i）用OVA、F7-PEI/OVA或F13-PEI/OVA NPs处理12h后BMDCs的抗原呈递效率。 j, k. 代表性流式细胞术图（j）和统计数据（k）。
2. 基于氟聚合物的纳米疫苗在体内表现出强大的免疫反应（图2-图4）
图2 纳米疫苗体外激活DC。a,b. 纳米疫苗的细胞摄取分析。 a. 流式细胞术检测CD11c+细胞与FITC-OVA,F7-PEI/FITC-OVA或F13-PEI/FITC-OVA孵育12小时后的平均荧光强度(MFI)。b. 流式细胞术检测来源于WT或Tlr4-/-小鼠的BMDCs细胞分别与F7-PEI/FITC-OVA 或 F13-PEI/FITC-OVA孵育后的细胞平均荧光强度。 c. 从wt小鼠和Tlr4-/-小鼠中收集的经相应样本处理后的BMDCs成熟水平。d. 分别以10μg ml-1 的OVA、F7-PEI、F13-PEI、F7-PEI/OVA或F13-PEI/OVA刺激HEK-Dual Null (NF/IL-8)细胞和HEK-Dual mTLR4 (NF/IL-8)细胞。以TLR4激动剂MPLA(1μg·ml-1)为阳性对照。
图3 F-PEI/OVA纳米疫苗的体内免疫刺激。a-b. 评估F-PEI/OVA纳米疫苗触发体内免疫反应的实验设计方案(a)和时间轴(b)。c-d. 具有代表性的流式细胞仪数据(c)和统计数据(d)，显示不同剂型NPs在免疫后第3天体内诱导DC成熟。e. 免疫后第5天淋巴结中表达SIINFEKL的树突状细胞的比例。f, g. 免疫后第7天免疫小鼠血清中ova特异性IgG2a:IgG1的值(f)和IFN-γ的产生(g)。h, i. 免疫后第7天脾脏CD3+CD8+ T细胞H-2Kb /SIINFEKL四聚体染色代表性流点图(h)和统计数据(i)。j, k. 免疫后第7天，用ELISPOT法测定的IFN-γ固定点形成细胞(SFCs) (j)和统计数据(k)。l. 免疫后第7天再刺激脾细胞CD8+ T细胞中IFN-γ阳性细胞的百分比。
图4 F13-PEI/OVA纳米疫苗可抑制肿瘤生长并延长荷瘤小鼠的生存期。a-c. 基于F-PEI/OVA的纳米疫苗预防B16-OVA黑色素瘤的效果。d-f. F-PEI/OVA纳米疫苗抗肿瘤治疗效果。a,d. 实验设计方案。b,e. 不同方案治疗后小鼠B16-OVA肿瘤的平均生长曲线(每组6只生物独立小鼠)。f. 不同组B16-OVA肿瘤小鼠在不同治疗后的无病生存。
3. 基于氟聚合物的个性化纳米疫苗用于治疗手术后的远端肿瘤（图5）
图5 F13-PEI/Mem纳米疫苗与ICB疗法协同治疗术后远程肿瘤。a, b. 手术切除的肿瘤获得的肿瘤细胞膜中制备F13-PEI/Mem NPs作为个性化的肿瘤纳米疫苗的方案。(a)与ICB治疗联合使用，以抑制每只小鼠另一侧肿瘤的生长的时间轴(b)。c, d. B16F10肿瘤的远处肿瘤生长曲线(c)和不同组小鼠(d)不同治疗后的无病生存曲线。e. CT26肿瘤的远处肿瘤平均生长曲线。f, g. CT26荷瘤小鼠在不同治疗方案治疗后，肿瘤体积的变化(f)和小鼠的无病生存曲线(g)。h. 用抗CD8a或同型单克隆抗体治疗3天后进行T细胞流式细胞术分析作为对照。i. 用F13-PEI/Mem与抗CTLA4联合治疗抗CD8a或同型单克隆抗体预处理的荷瘤小鼠，小鼠远处肿瘤生长曲线。
4. 基于聚合物的个性化疫苗治疗术后原位乳腺癌肿瘤转移（图6）
图6 F13-PEI/MEM 纳米疫苗与ICB疗法的协同作用及长期记忆免疫反应，可在术后治疗原位4T1肿瘤。a. 在原位4T1乳腺肿瘤模型中使用个性化疫苗联合抗CTLA4疗法抑制术后自发性肿瘤转移示意图。b. 体内生物发光图像跟踪术后4T1-luc乳腺癌细胞的转移情况。c，术后发生自发转移的原位4T1肿瘤小鼠在不同治疗后的生存情况。d-j. 术后F13-PEI/Mem联合抗CTLA4治疗后存活的小鼠在第120天再次接受4T1-Luc细胞挑战。d, e. 小鼠肿瘤生长曲线(d)和无病生存曲线(e)。第120天，在用继发性肿瘤对小鼠进行攻击之前，通过流式细胞术（在CD3+CD8+ T细胞门控）分析了外周血中的代表性流点图（f）和TEM（g）和TCM（h）的统计数据。小鼠继发肿瘤再次攻击7天后分离的小鼠血清中TNF-α(i)和IFN-γ(j)水平。
总之，在这项工作中，作者报告了一种通用的策略，以氟化高分子聚合物F-PEI为基础，制备肿瘤纳米疫苗,用于术后癌症免疫治疗。此类F-PEI通过简单混合即可与蛋白质抗原或肿瘤细胞膜抗原自组装，形成大小均匀的NP。该纳米疫苗既能充当免疫佐剂，还能够将抗原直接穿梭到APC细胞质中，触发强大的抗肿瘤反应，在术后肿瘤的个性化免疫治疗中具有较大的临床转化价值。
Xu J, Lv J, Zhuang Q, Yang Z, Cao Z, Xu L, Pei P, Wang C, Wu H, Dong Z, Chao Y, Wang C, Yang K, Peng R, Cheng Y, Liu Z. A general strategy towards personalized nanovaccines based on fluoropolymers for post-surgical cancer immunotherapy. Nat Nanotechnol. 2020 Dec;15(12):1043-1052. doi: 10.1038/s41565-020-00781-4.
