CELL丨 使用CRISPR-Cas13a和手机摄像头对SARS-CoV-2进行无扩增检测

作者：毛梦寒

2020年12月4日，Cell在线发表"Amplification-free detection of SARS-CoV-2 with CRISPR-Cas13a and mobile phone microscopy"。这种检测方法基于CRISPR-Cas13a，无需扩增，利用手机摄像头在5分钟内就可出阴阳性结果，30分钟提供病毒定量结果，灵敏度达到100拷贝/μL，有望在COVID-19全球流行的背景下提供快速而经济的检测支持。

SARS-CoV-2是一种主要由呼吸道传播的RNA病毒，现有检测的金标准是RT-qPCR，包括将病毒RNA转化为更稳定的DNA以及扩增步骤，以提高检测的灵敏度。该项技术需要专用试剂、实验室设备以及专业的检测人员，耗时较长，在流行病暴发时难以应对突增的检测需求。并且由于检测点常常有人员聚集，可能导致疫情进一步扩散的风险。

本文作者之一的Doudna教授因发现CRISPER-Cas基因组编辑技术获得今年的诺贝尔化学奖。在CRISPR-Cas13a系统中，Cas蛋白与crRNA结合形成复合物RNP，在RNP中Cas的核酸酶活性被抑制，当RNP中的crRNA与互补靶RNA结合时，Cas的核酸酶活性被激活，不加选择地裂解周围ssRNA。与切割DNA的Cas9蛋白不同，Cas13a可以结合并切割RNA。在该检测系统中，Cas13a蛋白与SARS-CoV-2核蛋白基因来源的crRNA结合形成RNP，ssRNA两端连有荧光基团以及荧光淬灭剂，当ssRNA被裂解时释放荧光基团从而发出荧光，荧光被手机摄像头采集信号。

 

图1.工作原理

研究者先针对SARS-CoV-2的N基因设计了12个crRNA以供检测，其中10个crRNA都可以成功激活Cas13a的核酸酶活性，crRNA2和4的效果最好。由于每种RNP指向同一病毒靶RNA的不同区域，因此单个靶RNA可以激活多个RNP，使有活性的酶浓度加倍。实验证明联合多种crRNA可以进一步提高检测系统的灵敏度，这也是此项工作的关键进展。该项技术可检测低至约30拷贝/μL的核酸浓度。

 

图2.筛选cRNA

 

图3.证明组合crRNA2和4可提高灵敏度

在信号的读取部分，研究者验证与酶标仪相比，手机采集信号更加集中，误差更小。该检测方法可以直接将荧光信号转化为病毒载量，从而更好地监测感染病程。

 

图4.验证手机直接检测的可行性

综上，该研究整合了之前CRISPR-Cas13a无需预先扩增的检测优势以及手机用于居家检测的优势，提供了一种快速（30分钟）、高灵敏度（~100拷贝/μL）的RNA病毒检测方法。未来可进一步改进报告基因的选择以及探测装置和摄像头的感光度，以优化这一方法。

.Parinaz Fozouni et al. Amplification-free detection of SARS-CoV-2 with CRISPR-Cas13a and mobile phone microscopy. Cell, 2020, doi:10.1016/j.cell.2020.12.001.