韩 达 课 题 组

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NAT COMMUN丨采用适配体功能化的纳米颗粒清除血液致癌性外泌体至小肠

作者:田园

今天给大家分享是近期发表在“Nature Communication”上的一篇文章。题目为“Eliminating blood oncogenic exosomes into the small intestine with aptamer-functionalized nanoparticles”。文章的通讯作者是来自福州大学,肿瘤转移预警与预防研究所的贾力教授。贾力教授课题组研究方向主要涉及抗肿瘤药、抗结核/AIDS药、心血管药、一氧化氮(NO)生物学、药物的药理和毒理、中草药、药化特性、药物分析、吸收分布、代谢及其排泄(ADME) 、蛋白组学、以及纳米药物等。

人体内通常有两种清除血液内物质的方式:1)肾脏过滤:即通过排尿的方式清除;2)肝胆清除:即肝胆消化后经Oddi's括约肌排入小肠的方式清除。直径小于6nm的物质通常通过肾小球滤过清除,而直径更大的物质则通过肝胆清除方式进入小肠。血液中的氧气和营养物质通过肝动脉和门静脉进入肝脏,并从肝静脉和下腔静脉流出,留下的一些循环物质则通过有孔血管内皮转移到狄氏腔并进一步由肝细胞胞吞后转移。最终这些物质被转移到胆管并排泄。通过这种方式被清除的物质包括分子量为290-1300Da大小的药物,如IgA、胰岛素样生长因子等。作者猜想是否可以通过这种代谢方式将人体内的一些生物危害的物质从血液中清除到小肠中。

外泌体是由细胞生成并释放的细胞外囊泡,直径通常在40-150nm左右,天然存在于血液中,参与细胞间物质的交换。外泌体的直径和它的磷脂双分子层结构有助于它们能有效的进入其他细胞。致癌性外泌体由肿瘤细胞分泌,其表面常表达特异性标志物,如四跨膜蛋白(CD9、CD63、CD81和CD82)以及表皮生长因子(EGFR、ErbB-1和Her1)等。作者前期研究发现,双适配体或双抗体能特异性捕获循环肿瘤细胞。因此,作者提出假说,合适的、安全的、生物材料也许能特异性地在血液中与有害的物质结合从而使其通过Oddi's括约肌排泄到小肠。

介孔二氧化硅纳米粒子(MSNs)是一种安全的生物材料,能被肝脏迅速摄取并排泄到胃肠道。在这份研究中,作者采用化学方法使识别EGFR适配体结合到MSNs,构建得的MSN-AP特异性能识别高表达EGFR的外泌体A-Exo。A-Exo由人肺癌细胞系A549分泌的外泌体。MSN-AP和外泌体A-Exo之间的分子间结合力,包括识别力和电荷力,使A-Exo的肝胆消除成为可能。作者介绍的这种创新性的生物技术将为清除生物危害的外泌体提供了一种新思路。

 

图1 外泌体的构建及表征

 

外泌体的表征

为验证MSN-AP是否能特异性识别A-Exo,作者首先分离出由A549细胞分泌的A-Exo;作为对照,作者还从肺成纤维细胞培养液中分离出了H-Exo (图1a)。采用原子力显微成像技术和透射电镜技术,明确了H-ExoA-Exo的平均直径都在97.9nm-130.1nm之间,提示这些外泌体大小具有很好的均一性(图1b-e)。H-ExoA-ExoZeta电位分别为-33.8mV和-32.4mV。纳米粒子追踪分析结果显示,每微克的外泌体包含有2x107个外泌体(1g1h)

为了更好的分析外泌体的动态生物分布,作者采用外泌体转染试剂盒,将一段外源性的DNA片段转染入H-ExoA-Exo (1a)RT-qPCR结果显示,每微克A-Exo带有9.4fmole的外源性DNA,而每微克H-Exo带有39.4fmole的外源性DNA。进一步研究显示50.5%A-Exo表达高水平的EGFR,而仅有0.8%H-Exo表达有EGFR(图1f)。

 

2 MSN的功能和特性

 

MSN的功能和特性

为探究MSN电荷对其组织分布和细胞运输的影响,作者将十六烷基三甲基氯化铵(CTAC)和三乙醇胺(TEA)在乙醇中反应从而形成一种表面活性的模版,使得MSN同时带有正负表面电荷。氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)和原硅酸四乙酯(TEOS)也被加入从而形成胺化产物MSN-NH2,即带正电的MSN (图2a);MSN-NH2进一步与琥珀酸酐反应,形成MSN-COOH,带负电的MSN(图2a)。为使功能化的MSN能特异性的识别并结合外泌体,作者先分别使用Cy3Cy5分别标记抗EGFR的适配体,再将带有Cy3Cy5的适配体共轭连接到带有负电或带有正电的MSN上,使得带有正电或负电的MSN能通过荧光被观测。

TEMAFM成像显示,适配体修饰后的MSN呈均匀六边形形状,平均直径约为70 nm,提示适配体的修饰和正负电改变不会影响MSN材料的大小(图2b-f)。羧化和胺化确实改变了MSN材料的Zeta点位,但带有负电荷的适配体仅轻微改变了MSN材料的电性。另外,MSN-AP能在全血稳定存在至少8小时。

 

3细胞培养基和大鼠血液中MSN-APA-Exo的识别和结合。

 

体外实验探究MSN-APA-Exo的结合性

作者首先在培养基中,将分别带有正负电的MSN-APA-ExoH-Exo孵育,Confocal显微技术和流式技术显示,和带负电的MSN-AP相比,带有正电的MSN-APA-Exo的结合显著增多(3倍左右);另外,两种MSN-APH-Exo几乎不结合(图3a-e)。进一步在大鼠全血中验证MSN-APA-Exo的结合,结果显示,无论是震荡还是静置条件下,和带有负电的MSN-AP相比,带有正电的MSN-APA-Exo的结合更多。

 

4 MSN-APA-Exo的体外结合及其通过肝细胞的动态运输

 

验证MSN-Exo是否能穿越肝细胞

肝脏主要由两种类型的上皮细胞组成:极化的肝细胞、占实质细胞60-80%的实质细胞和胆管细胞,其中胆管细胞是在肝内胆管内衬的上皮细胞,占肝细胞总数的3-5%。其他细胞包括Kupffer细胞,它们占人体巨噬细胞总数的80–90%。为验证MSN-APA-Exo结合后是否能穿越过这些细胞,作者首先将带正负电性的MSN-APA-Exo共孵育一小时,然后通过荧光共聚焦显微成像技术,延时观测其在LO2人肝癌细胞的运输以及胞吐作用。结果显示LO2肝细胞能轻易的摄取MSN-Exo,并在摄取20分钟后将其分泌出来。Transwell实验证实LO2分泌出的是完整的MSN-Exo颗粒(图4a-e)。

为进一步分析MSN-Exo是否能被肝细胞摄取和胞吐,作者在Transwell3D培养了LO2肝细胞,内皮细胞和胆管细胞,并将MSN-Exo加到顶层细胞之上,之后收集底层小室的液体。作者发现,3D培养的kupffer细胞能大量吞噬并消化MSN-Exo (4g-h),另外,共孵育600分钟后,kupffer细胞能显著降解MSNExo

 

5 MSN-APA-Exo之间的体内结合可加速循环A-Exo的肝胆排泄。

 

Exo的体内动力学分布和分泌

为探究A-Exo在小鼠体内的动态分布情况,作者将A-Exo外泌体、MSN-AP分别通过尾静脉注射到小鼠体内,并通过RT-qPCR定量分析小鼠胆管分泌的外泌体。结果显示注射MSN-AP显著增加小鼠胆汁中A-Exo外泌体的量。进一步实验显示,MSN-AP显著降低小鼠全血A-Exo量,且MSN-AP通过使A-Exo富集到肝和小肠来减少血液中A-Exo水平(5a)

 

6 MSN-AP消除动物和患者血液中循环外泌体的作用或使其失活

 

6a说明了MSN-AP如何识别并结合靶向的血液外泌体,并通过Oddi's括约肌横穿肝脏微环境进入胆管和小肠。带正电的MSN-AP利用其静电吸引的优势结合A-Exo的负电表面和肝细胞来完成该过程。作者综合了血液A-Exo的动态变化与肝脏和小肠的变化,发现存在MSN-AP时血液A-Exo的减少依次伴随着肝脏A-Exo的减少和随后的小肠中A-Exo的增加(图6b)。这些结果证实血液MSN-AP可以与靶向的A-Exo结合,而这两种化合物可以通过全身循环一起横穿进入肝胆排泄物。

接下来作者探究了血液中A-Exo的减少是否可以减弱A-Exo诱导的肺癌转移。A549细胞皮下植入裸鼠2周后,每3天(从A549植入后的第14天开始)静脉给小鼠静脉注射盐水,MSNMSN-APA- Exo。图6c-e显示了致癌性外泌体诱导的A549 CTC向小鼠肺的亲器官性的转移。连续三周注射A-Exo可促进小鼠A549 CTC的肺特异性转移,而这种肺转移则可以通过MSN-AP治疗而加以抑制。

为了进一步测试MSN-AP(用Cy-5标记)结合人癌症外泌体的特异性,作者收集了八名肺癌患者的血液样本,并向其中添加了MSN-AP(终浓度为40μg/ ml)。 通过分析Cy5荧光信号,通过流式细胞术在患者血液中鉴定并定量了MSN-AP结合的EGFR外泌体(图6f-g)。 作者明确了EGFR阳性外泌体的数量与患者癌症分期密切相关。

结论

基于作者先前开发的用于体内捕获CTC的生物技术,这项研究进一步证明,智能设计的安全生物材料可以精确地识别,结合并从血液中拖曳具有生物危害的物质进入胆管以消除。 也就是说,只要知道该生物危害的分子结构和理化特性,就可以通过Oddi's括约肌将血液中的致病生物危害物排泄入小肠从而清除到体外。

2021年1月9日 19:28
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